鸟类的垃圾DNA可能是安全、有效的基因治疗的关键

　　最近批准的一种治疗镰状细胞病的CRISPR-Cas9疗法表明，基因编辑工具在敲除基因以治疗遗传性疾病方面可以做得很好。但是，将完整的基因插入人类基因组以替代有缺陷或有害的基因仍然是不可能的。

　　一项利用鸟类逆转录转座子将基因插入基因组的新技术为基因治疗带来了更大的希望，因为它将基因插入到人类基因组的“安全港”中，在那里插入不会破坏基本基因或导致癌症。

　　逆转录转座子，或逆转录元件，是DNA片段，当转录成RNA时，为酶编码，将RNA复制回基因组中的DNA，这是一个自我服务的循环，使基因组与逆转录转座子DNA混在一起。大约40%的人类基因组是由这种“自私的”新DNA组成的，尽管大多数基因都是残疾的，即所谓的垃圾DNA。

　　这项新技术被称为精确rna介导的转基因插入(Precise RNA-mediated INsertion of Transgenes, PRINT)，利用一些反转录转座子的能力，在不影响其他基因组功能的情况下，有效地将整个基因插入基因组。PRINT将补充CRISPR-Cas技术的公认能力，使基因失活、产生点突变和插入短段DNA。

　　PRINT是由加州大学伯克利分校分子和细胞生物学教授凯瑟琳·柯林斯(Kathleen Collins)的实验室开发的，其描述发表在2月20日的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上。

　　PRINT涉及到将新的DNA插入细胞，使用类似于将CRISPR-Cas9运送到细胞中进行基因组编辑的递送方法。对于PRINT，一段传递的RNA编码一种叫做R2蛋白的常见逆转录因子蛋白，它有多个活性部分，包括一种结合和切割双链DNA的酶，以及一种产生RNA DNA拷贝的酶。另一种RNA是要插入的转基因DNA的模板，加上基因表达控制元件——一个完整的自主的转基因盒，R2蛋白插入到基因组中，柯林斯说。

　　使用R2蛋白的一个关键优势是，它将转基因插入基因组的一个区域，该区域包含数百个相同的基因拷贝，每个拷贝都编码核糖体RNA，即将信使RNA (mRNA)翻译成蛋白质的RNA机器。有如此多的冗余拷贝，当插入破坏一个或几个核糖体RNA基因时，基因的丢失不会被遗漏。

　　将转基因放入安全港避免了通过人类病毒载体插入转基因时遇到的一个主要问题，这是目前常见的方法:基因通常被随机插入基因组，使工作基因失效或扰乱基因的调节或功能，可能导致癌症。

　　“基于crispr - cas9的方法可以修复突变的核苷酸或插入一小块dna序列修复补丁。或者你可以通过特定位点的突变来破坏基因功能，”担任沃尔特和露丝舒伯特家族主席的柯林斯说。

　　“我们不是在破坏基因功能。我们不是在修复内源性基因突变。我们正在采取一种互补的方法，即在基因组中加入一种自主表达的基因，这种基因可以产生一种活性蛋白质，然后添加一种功能基因作为缺陷旁路。这是转基因补充而不是突变逆转。为了修复由同一基因的一系列个体突变引起的功能丧失疾病，这是伟大的。”

　　许多遗传性疾病，如囊性纤维化和血友病，都是由同一基因中许多不同的突变引起的，所有这些突变都使该基因的功能失效。任何基于crispr - cas9的基因编辑疗法都必须针对一个人的特定突变进行定制。使用PRINT进行基因补充可以将正确的基因传递给每个患有这种疾病的人，使每个病人的身体都能产生正常的蛋白质，而不管最初的突变是什么。

　　许多学术实验室和初创公司正在研究利用转座子和反转录转座子插入基因进行基因治疗。生物技术公司正在研究的一种流行的逆转录转座子是LINE-1(长穿插元件-1)，它在人类中复制了自己和一些搭便车的基因，覆盖了大约30%的基因组，尽管今天只有不到100个我们基因组的LINE-1逆转录转座子副本具有功能，只是基因组的一小部分。

　　Collins与加州大学伯克利分校的博士后同事Akanksha Thawani和加州大学伯克利分校分子和细胞生物学系的杰出教授Eva Nogales以及霍华德休斯医学研究所的研究员一起，于12月14日在《自然》杂志上发表了由LINE-1逆转录因子编码的酶蛋白的低温电子显微镜结构。

　　柯林斯说，这项研究清楚地表明，LINE-1反转录转座子蛋白很难安全有效地将转基因插入人类基因组中。但先前的研究表明，插入基因组中重复的核糖体RNA编码区域(rDNA)的基因可以正常表达，这向柯林斯提出了一个不同的逆转录因子，称为R2，可能对安全的转基因插入更有效。

　　由于R2在人类中没有发现，Collins和来自加州大学伯克利分校的高级研究员Xiaozhu Zhang以及博士后Briana Van Treeck从超过20种动物基因组中筛选了R2，从昆虫到马蹄蟹和其他多细胞真核生物，找到了一种高度靶向人类基因组rDNA区域的R2，并能有效地将长长度的DNA插入该区域。

　　柯林斯说:“在追了几十只之后，真正的赢家是鸟类。”其中包括斑胸草雀和白喉麻雀。

　　虽然哺乳动物的基因组中没有R2，但它们确实有R2作为逆转录因子有效插入所需的结合位点——这可能是一个迹象，她说，哺乳动物的祖先有一个类似R2的逆转录因子，但不知何故被踢出了哺乳动物的基因组。

　　在实验中，Zhang和Van Treeck合成了编码R2蛋白的mrna和模板RNA，该模板RNA将产生带有RNA聚合酶启动子表达的荧光蛋白的转基因。这些细胞被共转染到培养的人类细胞中。由于荧光蛋白在激光照射下的表达，大约一半的细胞亮起了绿色或红色，这表明R2系统已经成功地将一个有效的荧光蛋白插入到基因组中。

　　进一步的研究表明，转基因确实插入到基因组的rDNA区域，并且大约10个RNA模板拷贝可以插入而不破坏rDNA基因的蛋白质制造活性。

　　将转基因插入基因组的rDNA区域是有利的，除了它给了它们一个安全的港湾。rDNA区域位于五条独立染色体的粗短臂上。所有这些粗短的手臂挤在一起形成了一个叫做核核的结构，在核核中DNA被转录成核糖体RNA，然后RNA折叠成制造蛋白质的核糖体机器。

　　在核仁内，rDNA转录受到高度调控，基因经历快速修复，因为任何rDNA断裂，如果继续繁殖，可能会关闭蛋白质的产生。因此，任何插入基因组rDNA区域的转基因都会在核仁内受到小心翼翼的对待。

　　“核仁是一个巨大的核糖体生物发生中心，”柯林斯说。“但这也是一个非常优越的DNA修复环境，基因插入的致癌风险很低。这些成功的逆转录因子——我把它们拟人化了——已经进入了核糖体DNA，这真是太棒了。它是多拷贝的，它是保守的，从某种意义上说，它是一个安全的港湾，你可以破坏其中一个拷贝，而细胞不在乎。”

　　这使得该地区成为人类基因治疗植入基因的理想场所。

　　柯林斯承认，关于R2如何工作还有很多未知之处，关于rDNA转录的生物学问题仍然存在:在细胞关心之前，有多少rDNA基因可以被破坏?因为一些细胞关闭了人类基因组中400多个rDNA基因中的许多，这些细胞是否更容易受到PRINT副作用的影响?

　　她和她的团队正在研究这些问题，同时也在调整与逆转录因子插入有关的各种蛋白质和rna，以使PRINT在培养细胞和来自人体组织的原代细胞中更好地发挥作用。

　　不过，她说，底线是“它有效”。“只是为了真正利用它，我们必须对rDNA的生物学有更多的了解。”